流式細胞儀的原理是什么
流式細胞儀的原理是什么
可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因為這些生物學參數(shù)又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細胞由于光學性質(zhì)的改變，其散射光信號當然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。
在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對于形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。
在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。
減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統(tǒng)；③采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。
樣品分選原理流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。
穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數(shù)百μm。實驗經(jīng)驗公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數(shù)十ms。測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲?？筛鶕?jù)具體要求予以適當調(diào)整。
